تعیین و مقایسه میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان های ۲۴ ساعت, ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت در گروه شاهد
تعیین و مقایسه میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان های ۲۴ ساعت, ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت در گروه شاهد
تعیین و مقایسه میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان های ۲۴ ساعت, ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت در گروه مورد
تعیین و مقایسه میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان های ۲۴ ساعت, ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت در گروه مورد
مقایسه میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۲۴ ساعت
مقایسه میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۲۴ ساعت
مقایسه میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۴۸ ساعت
مقایسه میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۴۸ ساعت
مقایسه میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۷۲ ساعت
-۱۰مقایسه میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در دو گروه کنترل و مورد پس از ۷۲ ساعت
ج) اهداف کاربردی:
۱- ارزیابی تاثیر لیزر کم توان بر تکثیر فیبروبلاستهای پریودنشیم در محیط کشت
۲- ارزیابی تاثیر لیزر کم توان بر عملکرد فیبروبلاستهای پریودنشیم در محیط کشت
۳- ارزیابی تا ثیر لیزر کم توان بر بازسازی سلولها در پریو دنشیوم و تاثیر احتمالی آن در جراحی های رژنراتیو
د) فرضیات یا سؤالات تحقیق:
میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در گروه شاهد پس از ۲۴ ساعت,۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت یکسان است .
میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در گروه شاهد پس از ۲۴ ساعت,۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت یکسان است .
میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در گروه مورد پس از ۲۴ ساعت,۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت یکسان است .
میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در گروه مورد پس از ۲۴ ساعت,۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت یکسان است .
میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان ۲۴ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است.
میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان ۲۴ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است.
میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان ۴۸ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است.
میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان ۴۸ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است.
میزان تکثیر فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان۷۲ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است
۱۰-میزان عملکرد فیبروبلاستها در محیط کشت در زمان۷۲ ساعت در دو گروه مورد و شاهد یکسان است
ه) تعریف واژه‌های کلیدی به فارسی:
لیزر کم توان: نوعی از انواع لیزرهای light-emitting diodes می باشد که دارای خواص درمانی است.
لثه (gingiva) : قسمتی از مخاط دهان که بلافاصله دندان رویش شده را در بر می گیرد.
فیبروبلاست ( Fibroblast): یکی از سلولهای اصلی لیگامان پریودنتال است.
: Proliferation تکثیر سلولی
فصل سوم
مواد و روش های تحقیق

مواد و روشها:

کشت سلولهای فیبروبلاستی

کشت رده سلولی فیبروبلاستی لثه (HGF3-PI 53) ((NCBI code: C502)) بر اساس پروتوکل کشت سلولی مندرج در ATCC انجام گرفت. به این منظور از محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) حاوی ۱۰% سرم جنین گاو (FBS) استفاده گردید. به محیط کشت، ۲ میلی مولار ال-گلوتامین ، ۱۰۰ واحد در میلی لیتر پنی سیلین و ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین افزوده شد. سلولها در انکوباتور حاوی ۵% CO2 و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. تعویض محیط سلولها هر دو روز یکبار با بهره گرفتن از محیط کشت شرح داده شده در فوق انجام گرفت. بدین منظور محیط کشت رویی سلولها با بهره گرفتن از پیپت پاستور خارج گردیده و حجم ۶ میلی لیتر محیط تازه به هر فلاسک ۲۵ سانتی متر مربعی از سلولهای فیبروبلاستی افزوده گردید. پاساژ سلولها با بهره گرفتن از آنزیم تریپسین حاوی EDTA انجام گرفت (۰٫۰۵% Trypsin; 0.53 mM EDTA). به این منظور سلولها با بهره گرفتن از بافر PBS بخوبی شستشو داده شده و سپس ۱ میلی لیتر از محلول تریپسین به سلولهای چسبیده اضافه شد. پس از گذشت ۳ دقیقه خنثی سازی آنزیم با کمک سرم جنین گاو انجام گرفت و پس از سانتریفوژ و افزودن محیط کشت تازه سلولها یک فلاسک به سه فلاسک منتقل شدند. جهت نگهداری سلولها از ضد انجماد DMSO به همراه ۹۵% محیط کشت کامل استفاده شد. سلولها یک شب در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد فریز شده و سپس به تانک ازت مایع منتقل شدند. شمارش سلولها با بهره گرفتن از هماسیتومتر و میانگین سه بار شمارش انجام گرفت. برای اطمینان از زنده بودن سلولها قبل از آزمایش از رنگ حیاتی تریپان بلو با غلظت ۴/۰% استفاده گردید. رده سلولی HGF3-PI 53 از انستیتو پاستور و محیط کشت و سایر مواد از شرکت های گیبکو (Gibco) و سیگما (Sigma) تهیه شدند.

تابش لیزر کم توان

در این مطالعه از دستگاه لیزر کم توان گالیم – آلومینیوم- ارسناید (Ga–Al–As) با طول موج ۸۱۰ نانومتر و توان ماکزیمم ۵۰ میلی وات استفاده گردید (Advance Medical Manufacturing, Australia). سلولها به دو گروه تست و کنترل تقسیم شدند که در گروه تست به سلولها در سه روز متوالی در هر بار به میزان ۴ ژول در هر سانتی متر مربع تابش انجام گرفت ولی بر روی گروه کنترل تابشی انجام نشد. به این منظور، مدت زمان ۳۲ ثانیه به هر نقطه (با مساحت ۴/۰ سانتی متر مربع) تابش انجام گرفت. فاصله تقریبی بین لیزر تا سلولها ۵ میلی متر تنظیم شد. از سلولهای مورد تابش قرار گرفته و کنترل در ساعات ۲۴ ، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از تابش آزمون MTT به منظور بررسی پرولیفراسیون سلولی و در ۷۲ ساعت پس از تابش آزمون RT-PCR به منظور بررسی بیان ژنهای نشانگر فعالیت سلول فیبروبلاستی انجام شد(۷۲).

آزمون رشد و تکثیر سلولی

روش MTT

این روش برای اندازه گیری لنفوکاینهای پرولیفراتیو، میتوژن ها، لیز شدن با واسطه کمپلمان، تعیین فاکتورهای رشد سلول T و بررسی اثرات سایتوتوکسیسیتی مواد و داروهای مختلف بر روی سلولها به کار گرفته می‌شود. آزمون MTT از تست‌های آزمایشگاهی و استاندارد کالریمتریک (ارزیابی بر اساس تغییر رنگ )می باشد و برای اندازه گیری فعالیت آنزیم هائی که MTT را به فورمازان که رنگ ارغوانی دارداحیا می‌کنند، بکار می‌رود. MTT زردرنگ در سلولهای زنده به فورمازان احیا می‌شود(۷۳). یک محلول قابل حل(معمولا"دی متیل سولفوکسید و محلول اسیدی اتانل یا یک محلول دترژانت مثل سدیم دودسیل سولفات در محلول رقیق شده اسیدکلریدریک) برای حل شدن محصول ارغوانی غیرقابل حل به محلول رنگی اضافه می‌شود. جذب این محلول رنگی بوسیله اندازه گیری در طول موج مشخص(معمولأ بین ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر) به وسیله اسپکتروفتومتر تعیین می‌شود. ماکزیمم جذب بستگی به حلال استفاده شده دارد. این تبدیلات هنگامی که آنزیم ردوکتاز فعال هست انجام می‌شود از این رو اغلب برای اندازه گیری سلولهای زنده به کار می‌رود.
وقتی میزان فورمازان تولید شده توسط سلولهای تیمارشده با کنترل مقایسته شود کارایی عاملی که باعث مرگ یا تغییر متابولیسم سلولها می‌شود توسط منحنی در پاسخ مشخص می‌شود.
MTT
فورمازان
تبدیل MTT به فورمازان
شکل ۳-۱
فرمول محاسبه MTT :

Vitality percent = ( Vital cells / Control cells ) × ۱۰۰

فاکتورهای موثر در MTT:

۱-تعداد سلول: تعداد سلول بر حسب نوع سلول متفاوت است. معمولا برای سلولهای هیبریدوما، سلولهای توموری فیبروبلاست تعداد ۵۰۰۰ سلول برای هر ول استفاده می‌شود. اما هرچه تعداد سلول بیشتر باشد جذب نوری بالاتر خواهد بود. باید دقت کرد که اگر تعداد سلول بالاتر از حد لازم باشد باعث خطا در آزمایش خواهد شد.
۲-غلظت MTT: غلظت رنگ بسته به نوع سلول متفاوت است. معمولا غلظت ۵-۱ میلی گرم در میلی لیتر مورد استفاده قرار می‌گیرد.
۳-مدت انکوباسیون: معمولا ۴-۳ ساعت انکوباسیون سلولها همراه با رنگ کافی است. درموردی که احتیاج به تست سریع باشد می‌توان ۲ ساعت نیز انکوبه نمود.
۴-نوع حلال: معمولا از حلال ایزوپروپانل اسیدی و یا از حلال دی متیل سولفوکسید همراه بافر گلایسین، کلرید سدیم با ۵/۱۰PH= استفاده می‌شود.