سطح اسمیر با رد تیازین (۲ دقیقه) به عنوان رنگ زمینه لبریز ­گردید و مجددا” اسمیر شسته و خشک ­گردید .(Braon E.J and Sydney M.F., 1990)
برای تایید نهایی به روش ذیل-نلسون رنگ آمیزی ­گردید.

۳-۳-۳. رنگ­آمیزی ذیل-نلسون^[۶۹]
اصول
در این روش حرارت دادن لام­ها، نفوذ بیشتر کاربول فوشین را به درون دیواره سلولی باکتری­ ها فراهم می­نماید. اسید مایکولیک موم­ها با رنگ بازیک کمپلکسی تشکیل می­ دهند که اجازه خروج رنگ را از دیواره سلولی را با شستن بوسیله مواد رنگ زدای اسیدی نمی­دهند.
مواد مصرفی: فوشین بازیک، اتانول ۹۵ درصد، فنل کریستال، اسید کلریدریک غلیظ، متیلین بلو کلراید
آماده سازی مواد
فوشین: ۳/۰ گرم از فوشین بازیک در ۱۰ میلی­لیتر اتانول ۹۵ درصد حل گردید.
فنل: ۵ گرم فنل کریستال در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­گردید.
کربول فوشین: تمام محلول فوشین به ۹۰ میلی­لیتر از محلول فنل اضافه ­شد.
اسید الکل: با دقت ۳ میلی­لیتر اسید هیدروکلراید غلیظ را به ۹۷ میلی­لیتر اتانول ۹۵ درصد افزوده سپس به آرامی مخلوط گردید.
متیلن بلو: ۳/۰ گرم متیلن بلو کلراید در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­شد.
مراحل رنگ­آمیزی
بروی اسلایدها فوشین ریخته و ۵ دقیقه آنها را از روی شعله عبور داده، بطوری­که از روی رنگ بخار بلند ­شد.
سطح لام را با آب مقطر شسته و در ظرف اسید الکل به مدت ۲-۳ دقیقه قرار داده تا کاملا” رنگ­بری صورت گرفته شد.
اسمیر مجدد با آب مقطر شسته و خشک ­گردید.
سطح لام با محلول متیلن بلو آغشته ­گردید و اجازه داده ­شد این رنگ ۱ تا ۲ دقیقه برروی سطح لام بماند.
اسمیر مجدد با آب مقطر شستشو داده ­شد، خشک ­گردیده و سپس با بزرگ­نمایی ×۱۰۰ با روغن ایمرسیون مشاهده ­شد (بهره­ مند ا.ر.، ۱۳۷۲).
۳-۳-۴. رنگ­آمیزی کینون (رنگ آمیزی سرد)
اصول
با اضافه نمودن غلظت فوشین بازی و فنل نسبت به غلظت­های آنها در رنگ­آمیزی ذیل نلسون حرارت دادن لام­ها، لازم نمی ­باشد. به همین جهت به آن رنگ­آمیزی سرد می­گویند.
مواد مصرفی: فوشین فنلی کینیون، محلول رنگ­زدای اسید _ الکل و رنگ زمینه
آماده ­سازی مواد
فوشین فنلی کینیون: ۴ گرم از فوشین بازیک در ۲۰ میلی­لیتر اتانول ۹۵ درصد حل ­گردید و ۱۰۰ میلی­لیتر محلول فنل آبکی به آن اضافه ­شد.
محلول رنگ­زدای اسید _ الکل: ۳ میلی­لیتر اسید کلریدریک غلیظ به ۱۰۰ میلی­لیتر اتانول افزوده و سپس به آرامی مخلوط ­شد.
رنگ زمینه: ۳/۰ گرم متیلن بلو در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­شد.
مراحل رنگ­آمیزی
لام­ها را به مدت ۱۵ دقیقه در ۸۵ درجه سانتی ­گراد حرارت داده شد تا ثابت شوند.
روی لام­ها به وسیله فوشین بازیک کینیون پوشانده ­شد و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند.
لام­ها با آب بدون یون شسته و خشک ­شدند.
لام­ها به وسیله اسید – الکل ۳ دقیقه بی­رنگ شدند سپس با آب بدون یون شستشو داده ­شدند.
لام­ها مجددا به وسیله اسید – الکل ۲-۱ دقیقه بی­رنگ ­شدند تا هنگامی که هیچ رنگ قرمزی از لام در محلول اسید الکل مشاهده نگردید.
لام­ها را با آب بدون یون شسته و گوشه هر لام روی دستمال کاغذی قرار ­گرفت تا مایع سطح لام جذب ­شود.
لام­ها با محلول متیلن بلو بمدت ۴ دقیقه پوشانده ­شد.
لام­ها با آب بدون یون شسته و خشک ­گردید.
لام­ها با عدسی x400 میکروسکوپ سپس با عدسی x1000 جهت بررسی باسیل اسید فاست بررسی گردید .(Braon E.J and Sydney M.F., 1990)
۳-۳-۵. بررسی و آزمایش گسترش
تعداد باسیل­های اسید فست مشاهده شده بصورت جدول زیر گزارش ­گردید:
جدول۳-۱: نحوه گزارش میکروسکوپی