۰٫۰۱۲۵

۰٫۰۱۲۵

CUSO4.O aq.

۰٫۰۰۰۵

۰٫۰۰۰۵

d.l. cysteine HCI

۰٫۰۳

-

Glutathione

-

۰٫۰۱

yeast extract (freshly prepared)**(ml)

۵

۵۰

Starch

۱٫۵

۱٫۵

۲-۱-۴٫جداسازی سلول باکتری ازکشت^[۱۲۰]
در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی برای جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت از ترسیب شیمیایی توسط اسید کلریدریک استفاده می شد. این روش برای اولین بار توسط Pusztai و Juhazانجام شد که در سال ۱۹۶۱ ترسیب سلول باکتری توسط اسید را تشریح نمودند. در این روش با افزودن اسید کلریدریک به محیط کشت اسیدیته به ۴ می رسد و سپس سلول های باکتری سریعاً رسوب می کنند. مقدار رسوب بطور معمول در این روش ۵-۳ % حجم کل کشت می باشد. در بررسی های انجام شده توسط Vanfiemert (1967) در تجربیاتی نشان دادند که واکسن ترسیب یافته با اسید معمولاً توکسیسیتی بالاتری نسبت به واکسن ترسیب شده با سانتریفوژ دارد. در حالیکه واکسن های تهیه شده توسط سانتریفوژ توانمندی بالاتری نسبت به واکسن ترسیب شده با اسید نشان دادند (۶۰).

۲-۲٫ تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی
در انستیتو رازی تهیه واکسن سیاه سرفه از سال ۱۳۲۸ شمسی با کشت باکتری بر روی محیط جامد بورده-ژانگو که به آن خون گوسفند افزوده می شد، شروع شد.
سپس در سال ۱۳۳۱ شمسی محیط جامد جای خود را به محیط مایع کوهن- ویلر داد و بر روی این محیط هشت سویه باسیل سیاه سرفه که از مؤسسات بهداشت ایالتی نیویورک و میشیگان بدست آمده بود بویژه سویه های ۴۰۱۰۳، ۴۱۴۰۵، ۴۴۱۲۲، ۱۸۳۲۳ کشت می گردید.
درسال ۱۳۳۵ شمسی مرحوم پروفسور میر شمسی با دکتر بیودل که مسئول تهیه واکسن سیاه سرفه در مؤسسه دولتی باکتریولوژی استکهلم بود روش کشت در محیط مایع و دمیدن هوای پاک و عاری از آلودگی را در انستیتو رازی به وسیله مرحوم دکتر محمد حسین تسلیمی که از آغاز تولید واکسن سیاه سرفه مسئول و مجری برنامه تولید این واکسن بودند، اجرا نمودند. با روش هوادهی به کشت های حاوی باکتری سیاه سرفه میزان غلظت باکتری نسبت به کشت های بدون هوا به میزان ۳ برابر افزایش یافت.
استفاده از محیط مایع برای کشت باسیل سیاه سرفه بدان سبب اختیار شده بود که بسیاری از پژوهندگان معتقد بودند که ترشحات باسیل مذکور در کشت مایع محتوی عامل ایمنی بخش می باشد و شاید مایه ای که در محیط مایع تهیه شود بهتر از مایه تهیه شده در محیط جامد باشد.
در دهه ی ششم سه عدد فرمانتور جهت تهیه واکسن های میکروبی به ویژه واکسن سیاه سرفه خریداری و نصب شد. تهیه واکسن سیاه سرفه به مقیاس وسیع با بهره گرفتن از این فرمانتورها تا کنون ادامه دارد (۴).
همچنین در انستیتو رازی از مرتیولات (تیومرسال) به نسبت ۰۲/۰ درصد برای کشتن باسیل سیاه سرفه و به عنوان محافظ از آلودگی استفاده می­شد. قبل از افزودن مرتیولات سوسپانسیون غلیظ باسیل سیاه سرفه را مدت یک ساعت در بن ماری در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد گرم می کردند. بلافاصله کشت ها را سرد و به حرارت ۲۵ درجه سانتیگراد رسانیده و آنگاه مرتیولات افزوده شده و پس از برداشت نمونه جهت انجام تست های کنترلی نظیر استریلیتی و غیر فعال سازی، سوسپانسیون ها را در سردخانه ۸-۴ درجه سانتیگراد برای مدتی در حدود ۹-۶ ماه نگهداری می کردند (۴و۶۰).
پس از این مدت آزمایش های مکرر برای اطمینان از رفع سمیت سوسپانسیون میکروبی، عدم آلودگی و ایمنی دهی در موش سفید مطابق روش های توصیه شده بوسیله سازمان جهانی بهداشت انجام می گیرد.
۲-۳٫ غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه
از هنگامیکه در دهه ۱۹۲۰ میلادی Ramon خاصیت سمیت زدایی فرمالین راکشف کرد این ترکیب برای غیر فعال کردن توکسین ها، سلول های باکتریایی و ویروس ها مورد استفاده قرار گرفته است. با تولید واکسن هایی که بوسیله دستکاری ژنتیکی سمیت زدایی شده اند، فرمالین یک نقش جدید و مهم را به عنوان تثبیت کننده ی آنتی ژن های سمیت زدایی شده ژنتیکی کسب کرده است (۵۳).
۲-۳-۱٫ استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه
در اوایل دهه ۱۹۲۰، Ramon یک تثبیت کننده عمومی (فرمالین) را با هدف سمیت زدایی صاف شده کشت کورینه باکتریوم دیفتری بکار برد. Ramon پی برد که نگهداری صاف شده کشت دیفتری به همراه فرمالین نه تنها خاصیت سمی آن را خنثی می کند بلکه تزریق این صاف شده غیر سمی می تواند حیوانات را در مقابل اثرات کشنده سم دیفتری ایمن نماید. بدنبال آن پی برد که فرمالین می تواند برای سمیت زدایی توکسین دیفتری و تبدیل آن به واکسن بکار رود. سپس این تکنولوژی در غیرفعال سازی توکسین کزاز، سلولهای کامل باکتری و ویروس ها بکار رفت. نقش دوگانه فرمالین در غیرفعال سازی توکسین و تثبیت آنتی ژن ها در مدت زمان طولانی ذخیره سازی، قریب به ۷۰ سال است که به دفعات در موارد مختلف ثابت شده است (۵۳و۴۴).
این ویژگی منحصر به فرد فرمالین آنرا به یک ماده مهم و اساسی در تولید واکسن های باکتریایی و ویروسی تبدیل کرده است. واکسن های دیفتری و کزاز هنوز با روشی که Ramon در سال ۱۹۲۴ ارائه داده است، تولید می شود (۴۴).
بنابراین نباید تعجب کرد که حتی امروزه فرمالین یک ماده مهم و انتخابی در سمیت زدایی توکسین های جدیدی است که کاندید واکسن هستند. نمونه جدید آن را می توان در سمیت زدایی توکسین سیاه سرفه یافت(۲۵).
Munoz و Hestekin (1966) با بهره گرفتن از فرمالین و تیومرسال تغلیظ شده، باکتری سیاه سرفه را سمیت زدایی نمودند. آنها مشاهده کردند که سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه در مجاورت ۵/۰ درصد فرمالین در درجه حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یک هفته قادر است فعالیت توکسیستی سیاه سرفه را حذف نماید در حالیکه استفاده از تیومرسال با غلظت ۱:۱۰،۰۰۰ نتوانست فعالیت توکسیستی سیاه سرفه را حذف نماید. توانمندی واکسن فرمالین به میزان قابل توجهی کاهش یافت در حالیکه توانمندی واکسن تیومرسالی شرایط نرمال خود را حفظ کرده بود. در این آزمایش Munozو همکارش نشان دادند که سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه بدون غیر فعال سازی حرارتی در حضور ۵/۰ درصد فرمالین در درجه حرارت ۵-۲ درجه سانتیگراد در طول مدت ۲۷ هفته سمیت زدایی شده و توانمندی فرآورده نسبت به زمانیکه در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردد ثبات بیشتری را نشان می دهد. همچنین سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه که بدون غیرفعال سازی حرارتی در معرض تیومرسال ۱:۱۰،۰۰۰ در درجه حرارت ۵-۲ درجه سانتیگراد در طول مدت ۲۷ هفته سمیت زدایی شده، از نظر حفظ ثبات ایمنی زدایی شرایط بهتری را نسبت به فرمالین نشان می دهد (۴۴).