به منظور همسانه­سازی انتهای َ۳ و َ۵ در بتا-اکتین، چندین مرحله PCR با ۲ آغازگر Nested که در قطعه میانی آن طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل َ۳ و َ۵ ریس کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس مطابق بند ۳-۸-۷ انجام شد.
۳-۸-۹- آنالیز توالی­ها
اطلاعات مربوط به توالی­ها با بهره گرفتن از نرم­افزار Chromas Lite (v.2.1) (http://www.technelysium.com.au) رویت، توسط نرم­افزارGeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) گردآوری و ادغام [۷۵] و با بهره گرفتن از بلاست نوکلئوتید و پروتئین (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) آنالیز شد. برای ترجمه توالی از ORF به آمینواسید از ابزار ترجمه نرم­افزار ExPaSy (http://web.expasy.org) استفاده شد.

۳-۸-۱۰- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروس­ماهی زاینده­رود
پس از هم­ترازی^[۱۱۱] توالی پروتئینی به دست آمده از عروس­ماهی زاینده­رود و سایر توالی­های آمینواسیدی ماهیان و برخی دیگر از مهرا­داران تخم­گذار توسط ClustalW، آنالیزهای فیلوژنیکی و تکاملی توسط نرم­افزار MEGA5 انجام گرفت [۱۰۰]. تاریخچه تکامل با بهره گرفتن از روش Neighbor-Joining استنباط شد [۸۶]. تلفیق خودکار درخت، از ۱۰۰۰ تکرار به دست آمد. درصد تکرار درخت­هایی که در آن­ها گروه یکسانی از تاکسون­ها گرد هم آمدند، در کنار شاخه­ها نشان داده شد [۳۳]. این درخت بر اساس مقیاسی ترسیم گردید که در آن طول شاخه­ها دارای واحد یکسان با فواصل تکاملی مورد استفاده در استنباط درخت فیلوژنی است. فواصل تکاملی با بهره گرفتن از روش اصلاحی Poisson محاسبه شد [۱۱۲]. این فواصل بر اساس واحدهایی از تعداد ­ آمینواسید های جایگزین در هر جایگاه است. در این آنالیز از ۵۷ توالی آمینواسیدی استفاده شد. تمام جایگاه­هایی که فاقد اطلاعات یا دارای وقفه در اطلاعات بودند، حذف شدند. مجموعه نهایی داده ­ها دارای ۶۰۶ جایگاه متغیر آمینواسیدی بود.
۳-۸-۱۱- اندازه ­گیری بیان ژن از طریق PCR کمی (QPCR)^[112] رونوشت معکوس
استخراج RNA کل و تعیین کیفیت و کمیت آن با بهره گرفتن از روش ارائه داده شده در بند ۳-۸-۲ تعیین گردید. تنها نمونه­هایی از RNA که دارای RIN بالاتر از ۷ بودند برای اندازه ­گیری کمی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. کمی سازی با بهره گرفتن از سایبر گرین^[۱۱۳] و در دستگاه مسترسایکلر اپگرادیانت اس ریل پلکس ۲^[۱۱۴] و نرم افزار Realplex software (v.2.2) (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
در این مطالعه، به منظور نرمال­سازی واریانس بین داده ­ها و امکان مقایسه آن­ها از ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. با وجود این­که واریانس بتا-اکتین تحت شرایط آزمایش ما ۳۵/۱ C_T بود، نتایج بر اساس آن نرمال سازی شد.
RNA کل به روشی که قبلا در بند ۳-۸-۳ توضیح داده شد، به­ صورت معکوس رونویسی شد. سپس cDNA با بهره گرفتن از محلول ۱۰ میلی مولار Tris-HCl و ۱/۰ میلی مولار EDTANa₂ با pH 8.0، ۱۰ برابر رقیق شد. واکنش­هایQPCR با ۱۰ نانوگرم از cDNA، ۲۰۰ نانومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس (جدول ۳-۲) و پرفکتا سایبر گرین فست میکس^[۱۱۵] (ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز) انجام شد. واکنش­ها درون پلیت­های ۱۰ میکرولیتری سمی-اسکرتد تواین تک Real-time PCR 96^[116] (ساخت شرکت اپندورف) پوشیده شده با ادهسیو مسترکلیر Real-time PCR فیلم^[۱۱۷] (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
برنامه PCR شامل ۵ دقیقه مرحله واسرشته­سازی اولیه و فعال­سازی پلیمراز در C°۹۵، ۴۰ سیکل تکثیر (واسرشته­سازی به مدت ۱۵ ثانیه در C°۹۵، الحاق به مدت ۳۰ ثانیه در C°۶۰ و بسط به مدت ۳۰ ثانیه در C°۶۰) و منحنی ذوب نهایی به مدت ۲۰ دقیقه ازC °۶۰ تاC °۹۵ بود.
منحنی ذوب به منظور حصول اطمینان از تکثیر تنها یک محصول و عدم وجود محصولات جانبی حاصل از پرایمر دایمر استفاده شد. به علاوه، محصولات PCR در ژل آگارز ۲% اجرا و سپس همسانه­سازی و توالی­یابی شدند. توالی­های به­دست آمده با ژن­های موردنظر مطابقت داشتند.
به­منظور بهینه سازی شرایط QPCR، ترکیب مختلف آغازگرها (۳ جفت برای بتا-اکتین و ۱۲ جفت برای ویتلوژنین)، دماهای مختلف الحاق (C°۶۰-۵۰) در آغازگرهای انتخاب شده و غلظت­های متفاوت از آغازگرها (۱۰۰، ۲۰۰ و ۴۰۰ نانومولار) و cDNA الگو (۵ سری رقیق سازی ۱۰/۱ از ۱۰ نانوگرم تا ۱ پیکوگرم) استفاده شد. در منحنی­های ذوب حاصل، راندمان تکثیر و r² برای ویتلوژنین و بتا-اکتین اندازه ­گیری شد. کمی سازی نسبی ژن با بهره گرفتن از روش مقایسه C_T (∆∆C_T) و مطابق با فرمول ذیل که به صورت خودکار توسط دستگاه محاسبه می­ شود، انجام گرفت [۶۷]:
(۳-۱۰)
در این رابطه، R بیان کمی ژن و C_T شماره سیکل آستانه تشخیص نور فلورسنت توسط دستگاه است که با میزان cDNA هدف همبستگی منفی دارد. یعنی هرچه میزان ژن هدف بیش­تر باشد تعداد سیکل لازم برای رسیدن به حد آستانه تشخیص توسط دستگاه کاهش می­یابد. Sample نمونه مورد آزمایش و Calibrator نمونه ­ای است که بیان ژن مورد نظر در نمونه نسبت آن توصیف می­ شود. در این مطالعه، نمونه شماره ۴ از ایستگاه چشمه­دیمه با جنسیت ماده به عنوان نمونه کالیبراتور انتخاب شد. معیار این انتخاب، جنسیت ماده و بنابراین اطمینان از وجود mRNA ویتلوژنین، بالا بودن غلظت RNA و داشتن RIN مناسب بود. منظور از Housekeeping gene، ژن کنترل داخلی است. این ژن­ها، کدکننده پروتئین­های لازم برای عملکردهای اساسی سلول هستند که معمولاً در بافت­های مختلف به یک میزان بیان می­شوند. شرط اصلی و لازم در انتخاب این ژن، ثابت بودن میزان بیان آن تحت شرایط آزمایش است. در این مطالعه، ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی انتخاب شد.
جدول ۳-۲) اولیگونوکلئوتیدهای طراحی شده برای حصول قطعات مورد نظر و آنالیز QPCR در ویتلوژنین و بتا-اکتین.